1、分泌物检查：男性患者可取泌尿生殖道分泌物、前列腺液、精液，定量培养可取初段尿、中段尿。女性除宫颈和阴道拭子外，羊水、尿道分泌物也可用于检测。
2、特异性抗体检测：若要测特异性抗体，可采集血液标本，标本采集后应尽快送检，一般不超过3小时，因支原体无细胞生殖，支原体感染部分患者可测出抗体，但敏感性不高，重复性差，未能用于临床。
3、聚合酶链式反应：由于其敏感性高，特异性好，现已从实验研究阶段进入临床应用阶段，逐步成为临床快速诊断的重要手段。
4、内镜检查：可直接观察泌尿生殖系统炎症病变，亦可从子宫内膜及输卵管取材分离支原体，阳性即可确诊。