1、血糖测定：空腹及发作时低血糖，发作时血糖低于2.8mmol/L(50mg/dI)。
2、胰岛素释放试验：正常人空腹胰岛素在172pmol/L(24μU/ml)以下，胰岛素瘤患者超过正常。一般采用胰岛素释放指数作为诊断指标，胰岛素释放指数=[血浆胰岛素(μU/ml)]/[血浆葡萄糖(mg/dI)]，正常人<0.3，胰岛素瘤患者>0.4，可在1.0以上。胰岛素释放修正指数=[血浆胰岛素(μU/ml)X100]/[血浆葡萄糖-30(mg/dl)]，正常人<50μU/mg，>85μU/mg提示本病。
3、饥饿试验(禁食试验)：必要时进行。胰岛β细胞瘤患者禁食12~18小时后，约有2/3的病例血糖可降至3.3mmol/L以下，24~36小时后绝大部分患者发生低血糖症(血糖<2.8mmoI/L，而胰岛素水平不下降)。如禁食72小时不发生低血糖症者，可排除本病。
4、刺激试验：葡萄糖刺激胰岛素释放试验(行4小时口服葡萄糖耐量试验，同时测定血糖和胰岛素)，如胰岛素高峰超过15μU/ml为阳性。
5、甲磺丁脲(D860)刺激试验，胰高糖素试验：可刺激胰岛素大量分泌而诱发低血糖，对病人比较危险，应严格掌握适应症，并在医生监护下进行。
6、影像检查：如超声和CT、MRI有助于肿瘤的定位诊断；但大部分肿瘤的瘤体较小(直径5.5~10mm)，可采用选择性腹腔动脉血管造影来进行术前定位。有条件可经皮肝穿刺插管做胰腺分段取血，测定胰岛素和C肽等。对疑有多发性内分泌腺瘤病患者，应做相应部位的定位检查及相关的实验室生化检查和激素测定。